II. Методические подходы к биохимическому анализу нейронов

Как видно из изложенного выше, основные биохимические особенности мозга касаются преимущественно динамической, а не функциональной биохимии мозга. Биохимическая основа кардинальных физиологических процессов в нейронах остается почти не изученной.

Это связано с рядом специфических особенностей нервной ткани, значительно затрудняющих ее биохимическое исследование.

Прежде всего следует подчеркнуть исключительно высокую скорость физиологических процессов, протекающих в нервных клетках. В электрофизиологических экспериментах регистрируются сдвиги функционального состояния нейрона в интервалы времени порядка миллисекунд; биохимики пока бессильны в улавливании столь быстрых изменений в ходе реакций обмена веществ.

Другим фактором, затрудняющим биохимическое исследование мозга, является особая чувствительность нервной ткани к гипоксии. В результате этого при таких неизбежных моментах, как забивание животных, извлечение мозга, его гомогенизация и т. п., всегда происходят посмертные изменения, которые в ряде случаев могут значительно исказить биохимическую картину мозговой ткани. Так, по данным Владимирова и Рубель (1954), уже через 30 сек. после обезглавливания животных содержание в мозгу креатинфосфата и АТФ резко снижается ввиду их распада, в результате чего уровень неорганического фосфата нарастает (рис. 1).

Рис. 1. Посмертные изменения в содержании фосфорных соединений в мозгу крыс. (Владимиров и Рубель, 1954). 1 - тотальное замораживание крыс в жидком О₂; 2 - обезглавливание животных с погружением головы в жидкий O₂ спустя 3 сек.; 3 - обезглавливание с погружением головы спустя 30 сек.; 4 - обезглавливание с погружением головы спустя 45 сек. I - неорганический фосфат; II - АТФ; III - креатин-фосфат

Наконец, мозг и вообще нервная ткань отличается выраженной морфологической гетерогенностью: на нервные клетки приходится, по данным разных авторов, от 2 до 8% от общей массы мозга. Остальную массу составляют отростки нервных клеток (аксоны и дендриты), тела и отростки макроглии, клетки микроглии, сосуды, соединительнотканные оболочки и т. д. Такая морфологическая сложность несомненно связана и с соответствующей сложностью биохимического состава мозговой ткани. Недавно Богох и сотрудники (Bogoch et al., 1964) выделили из больших полушарий мозга человека свыше 100 индивидуальных белков; по-видимому, часть этих белков имеет разное происхождение: из нейронов, из глии, из аксонов и т. п.

Из существующих методов биохимического анализа нейронов следует выделить 3 основных метода: топохимический анализ, микрохимические определения и гистохимическое исследование.

а) Топохимический анализ основан на биохимическом исследовании гомогенатов отдельных областей нервной системы, отличающихся по составу входящих в них клеточных элементов. Так, удобно сравнивать, например, кору головного мозга или мозжечка с мозолистым телом; в первом случае навеска для анализа содержит как нервные, так и глиальные клетки, во втором - глиальные клетки являются единственным видом клеток (Elliott a. Heller, 1957). Большое число исследований (Баранов и Певзнер, 1964) посвящено также сравнению разных слоев коры мозга. Однако топохимический анализ является по существу косвенным и не всегда надежным, так как, помимо нервных и глиальных клеток, в сравниваемых навесках всегда присутствуют и другие структурные элементы нервной ткани; при этом точное соотношение нервных и глиальных клеток, а также клеточных и неклеточных элементов, как правило, неизвестно.

б) Микрохимические определения связаны с выделением столь малых навесок нервной ткани, что объектом исследования является группа клеток или даже одна клетка (Lowry, 1953, 1957; Lowry et al., 1954, 1956; Hyden, 1955a, 1960; Giacobini, 1957, 1962). Эти исследования дают ценную информацию о химических изменениях в отдельных нейронах при разных функциональных состояниях нервной системы. Именно этими методами, как будет указано ниже, получены основные сведения о биохимических отличиях, например, между нейроном и нейроглией. Однако и данный методический подход, при всех его преимуществах, также не лишен недостатков. Основным из них является необходимость оперативных вмешательств на нервной ткани с выделением отдельных клеток, освобождением их от окружающей нейроглии, отделением аксона и дендритов и т. д. Такие вмешательства неизбежно вызывают ряд биохимических изменений в нейронах, при чем количественная оценка этих изменений крайне затруднительна.

в) Ценность гистохимического исследования заключается в возможности изучения клеток in situ, в их исходной связи с окружающими структурными элементами нервной ткани. Однако большинство гистохимических методов дает возможность лишь качественной оценки содержания того или иного вещества, по интенсивности соответствующей цветной реакции в препарате. Поэтому особо ценны те немногие гистохимические методы, которые позволяют количественно определять концентрацию исследуемого вещества в клетке или активность клеточных ферментов. Речь идет о методах цитофотометрии, основанных на измерении поглощения ультрафиолетового или видимого монохроматического света после прохождения его через соответствующие структуры гистологического препарата (Gaspersson, 1936, 1950; Бродский, 1956; Агроскин и др., 1960, и др.).

Комплексное применение всех указанных методов, с критическим анализом данных, полученных каждым методом, позволило накопить ряд достоверных сведений о некоторых биохимических характеристиках нейрона.