Занятие 33. Экспериментальный диффузный гломерулонефрит. Экспериментальная азотемическая уремия

Цель занятия

Изучить важнейшие показатели нарушения функции почек при экспериментальном цитотоксическом нефрите. Ознакомить студентов с картиной экспериментальной азотемической уремии.

Подготовка к занятию

Студенты готовятся к данному занятию в объеме следующих вопросов.

1. Современные представления о патогенезе диффузного гломерулонефрита.

2. Расстройства функции почек при гломерулонефритах.

3. Уремия, ее патогенез.

4. Экспериментальные модели нефритов.

^* (Приводимый перечень предусматривает полное техническое обеспечение одного рабочего места для 2-4 студентов по каждому опыту.)

Опыт 1а

² (При достаточной обеспеченности центрифугами предметы № 7, 8, 9 излишни.)

³ (Раствор готовят каждый день перед началом занятий путем прибавления чистого брома к 33% раствору едкого натра из расчета 20 капель на 10 мл раствора щелочи (работать под тягой!). Хранят в посуде из темного стекла.)

¹ (Удельного веса 1,40, разведенная дистиллированной водой 2 раза.)

Наименование опытов и методика их проведения

Опыт 1. Нарушение азотовыделительной функции почек у кроликов с экспериментальным цитотоксическим нефритом. На занятие берут 2 кроликов: одного с экспериментальным нефритом, другого интактного (кролики содержатся в обменных камерах для собирания суточной мочи).

У обоих кроликов определяют в моче и крови содержание мочевины газометрическим способом в аппарате Коварского (рис. 45).

Рис. 45. Аппарат Коварского

А. Определение мочевины крови. Способ основан на разложении мочевины бромноватистой щелочью. При этом выделяется в газообразном виде азот согласно следующему уравнению:

По объему выделившегося азота вычисляют содержание мочевины (см. ниже).

Ухо кролика протирают ватой, смоченной эфиром, и из краевой вены берут 2 мл крови (до первой метки) в сухую центрифужную пробирку с несколькими кристалликами оксалата калия на дне. Во время взятия крови пробирку непрерывно встряхивают для растворения оксалата. Затем приливают пипеткой равный объем (до второй метки) 20% раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения белков (насасывать осторожно!), тщательно размешивают тонкой стеклянной палочкой и оставляют на 5 минут, после чего центрифугируют (5 минут при 2500 об/мин) или фильтруют через маленький фильтр в мерный цилиндр на 10 мл.

Подготавливают к работе аппарат Коварского. Для этого открывают кран левого колена, а правый (трехходовой) кран устанавливают меткой от себя. В правое колено наливают насыщенный раствор хлористого натрия до тех пор, пока он появится слева над краном.

Нередко в правом колене под краном остается большой пузырь воздуха. Его легко выпустить, переводя на 1-2 секунды трехходовый кран в положение меткой на себя. После этого обычно приходится долить в правое колено еще немного солевого раствора.

Левый кран закрывают; солевой раствор из трубки над краном отсасывают пастеровской пипеткой с резиновой грушей. Затем трехходовому крану придают положение меткой вверх и спускают в стакан солевой раствор из правого колена больше чем наполовину. Затем переводят кран в первое положение (меткой от себя).

Вливают в градуированную трубку левого колена над краном точно 2,5 мл фильтрата крови и, открыв кран, осторожно спускают весь фильтрат (или центрифугат) в нижнюю, также градуированную, часть левого колена, после чего кран быстро закрывают. При помощи пастеровской пипетки обмывают верхнюю трубку 0,5 мл дистиллированной воды, которую спускают туда же.

Производя 2 последние операции, необходимо внимательно следить за своевременным перекрыванием левого крана. При несоблюдении этого условия, в нижнюю градуированную часть левого колена может попасть воздух. Этого следует тщательно избегать. Если все же кран был закрыт с опозданием и под ним оказался воздушный пузырек, вновь заливают в правое колено насыщенный раствор хлористого натрия до уровня, несколько превышающего уровень жидкости в левом колене. Осторожно приоткрывая левый кран, вытесняют воздух. Переводят правый кран в положение меткой вверх и спускают в стакан солевой раствор из правого колена больше чем наполовину. Затем вновь переводят кран в положение меткой от себя.

Вливают в верхнюю трубку 6-7 мл раствора бромноватистой щелочи и спускают 5-6 мл в нижнюю часть. Быстро закрывают кран. Немедленно начинается процесс растепления мочевины и выделения газообразного азота, который вытесняет часть солевого раствора из левого колена в правое.

Выжидают около 5 минут, пока образование пузырьков совершенно прекратится.

Переводят трехходовой кран в положение меткой вверх, дают стечь раствору из правого колена, вынимают аппарат из штатива и, осторожно наклоняя его, собирают со стенок все пузырьки газа в левое колено под краном, после чего переводят правый кран в положение меткой от себя, приливают в правое колено солевой раствор до одинакового уровня с левым.

После выравнивания уровней солевого раствора отмечают объем газа в миллилитрах. Количество мочевины определяют по табл. 4.

Таблица 4. Определение мочевины по Коварскому (1 мл азота соответствует 1 г мочевины в 1 л)

Необходимо учитывать барометрическое давление и комнатную температуру. На пересечении соответствующих столбцов таблицы находят число, на которое надо умножить полученный объем азота.

Результат представляет количество граммов мочевины в 1000 мл крови.

Обычно концентрацию мочевины в крови выражают в миллиграмм-процентах, для чего производят соответствующий простой пересчет.

Например, в аппарате Коварского выделилось 0,18 мл газообразного азота при комнатной температуре 20° и барометрическом давлении 745 мм рт. ст. В табл. 4 на пересечении соответствующих строчек находим число 1,92. Умножая на это число объем азота, получаем: 0 18×1,92 = 0,3456 или, округляя, 0,35. Таким образом, в 1000 мл крови содержится 0,35 г мочевины, что при пересчете на милллиграмм-проценты выразится числом 35.

Нормальное содержание мочевины в крови кроликов составляет 10-30 мг%.

Б. Определение содержания мочевины в суточной моче. Для исследования берут в стаканчик пипеткой 3-4 мл мочи, прибавляют другой пипеткой точно отмеренный равный объем 20% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают легким встряхиванием и оставляют на 5 минут. Затем фильтруют через бумажный фильтр в пробирку. Пипеткой отмеривают в другую пробирку точно 1 мл фильтрата и разбавляют его в 10 раз дистиллированной водой (приливая 9 мл воды). Перемешивают стеклянной палочкой.

Для определения берут в аппарат Коварского точно 2,5 мл разведенного фильтрата. В остальном поступают точно так же, как и при определении мочевины крови (см. выше).

Полученный объем азота умножают на 10 и на соответствующую цифру из таблицы. Концентрацию мочевины выражают в процентах.

Нормальное содержание мочевины в суточной моче кролика составляет около 2%.

По окончании опыта сопоставляют цифры, полученные у интактного и подопытного кроликов, и делают соответствующие выводы.

Опыт 2. Патологические составные части мочи при экспериментальном нефрите.

А. Микроскопическое исследование мочевого осадка. Из стакана, содержащего суточную мочу кролика, пипеткой осторожно набирают со дна некоторое количество (3-5 мл) мочи с осадком, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при 2500 об/мин. Прозрачную мочу быстрым наклоном пробирки сливают с осадка. Пастеровской пипеткой набирают немного осадка, наносят маленькую (!) каплю на предметное стекло и накрывают покровным. Микроскопируют при опущенном конденсоре и несколько суженной диафрагме, сначала для общего ознакомления при увеличении в 100-200 раз, затем более подробно при увеличении в 300-500 раз.

Б. Количественное определение содержания белка в моче. Установлено, что при содержании в моче 0,033% белка между 2-й и 3-й минутой после наслаивания мочи на азотную кислоту на границе двух жидкостей образуется тонкое, но отчетливо видимое белое кольцо (проба Геллера).

Для исследования берут 1,5-2 мл профильтрованной мочи и пипеткой осторожно наслаивают в пробирке на такой же объем заранее (за 3-5 минут) налитой азотной кислоты. Если при этом получается нитевидное кольцо к концу 3-й минуты, то в моче содержится 0,033%о белка. Если нитевидное кольцо появляется раньше, мочу разводят водой в 2 раза и повторяют пробу, регистрируя время появления кольца (время наслаивания принимают за ¹/₄ минуты).

Если появляется не нитевидное, а широкое кольцо, мочу разводят в 4 раза (1 часть мочи + 3 части воды).

Если кольцо, кроме того, имеет компактный характер, мочу разводят в 8 раз (1 часть мочи + 7 частей воды)^*.

^* (Это правило относится как к исходной моче, так и к любой степени ее разведения: если, например, моча, разведенная в 8 раз, после наслаивания дает широкое кольцо, то следует развести ее еще в 4 раза и т. д.)

Разведение повторяют до тех пор, пока при наслаивании на азотную кислоту получат образование нитевидного кольца в интервале между 1-й и 4-й минутой, после чего можно по упрошенному методу воспользоваться следующей ниже таблицей поправок.

Чтобы определить содержание белка в неразведенной моче, 0,033% умножают на степень разведения, а затем на то число таблицы, которое соответствует времени образования кольца. Например, при наслаивании мочи, разведенной в 8 раз, нитевидное кольцо образовалось через 1 минуту 50 секунд. Сразу определить содержание белка нельзя, так как кольцо образовалось раньше 2 минут. Пользуясь таблицей, находим, что в этом случае белка будет в 1¹/₈ раза больше, чем в том случае, если бы кольцо образовалось через 3 минуты. Содержание белка составляет, таким образом, 0,033% · 8 · 1¹/₈ = 0,297% или, округляя, 0,3%.

Опыт 3. Экспериментальная модель уремии у собаки. За 3-5 дней до занятия собаке в стерильных условиях производят перевязку обоих мочеточников. Во время занятия наблюдают клиническую картину уремии (подавленность, адинамия, жажда, рвота, характерный мочевой запах выдыхаемого воздуха и рвотных масс, падение температуры тела, коматозное состояние, судороги). Берут из поверхностной вены голени при помощи шприца 2 мл крови для определения мочевины (методика описана в опыте 1). Для сравнения исследуют кровь и измеряют температуру тела (ректальную или кожную) у интактной собаки.

Результаты и ход опытов протоколируют и анализируют.

Методика получения экспериментального цитотоксического нефрита у кроликов

Все операции производят в стерильных условиях!

У свежезабитого путем обескровливания кролика берут обе почки, удаляют капсулу, срезают корковое вещество, измельчают его ножницами в стеклянной чашке и тщательно промывают 5-8 раз физиологическим раствором комнатной температуры. Затем слегка отжимают, переносят в фарфоровую ступку и измельчают до консистенции гомогенной пасты. Полученную пасту взвешивают и прибавляют по расчету физиологический раствор в количестве, необходимом для получения 25% взвеси (3 объема физиологического раствора на 1 весовую часть пасты). Тщательно перемешивают и ставят на 2 часа в холодильник для отстаивания (последнюю операцию можно заменить центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3 минут). Во взвеси после этого можно различить 3 слоя: верхний - опалесцирующая жидкость; средний - мутная гомогенная жидкость и нижний - зернистый. Для иммунизации используют верхний и средний слои. Хранят в холодильнике при температуре 4-6°.

Иммунизация

Антиген вводят утке весом 2-2,5 кг внутрибрюшинно 6-8 раз из расчета: первая инъекция - 2 мл/кг веса, а каждая последующая - на 0,5 мл/кг более предыдущей, т. е. 2,5; 3; 3,5 мл/кг и т. д. Интервалы между инъекциями составляют соответственно 5, 5, 6, 6, 7, 7, 7 суток.

Получение нефротоксической сыворотки

Утку через 7 суток после последней инъекции обескровливают через полую иглу, введенную в подкрыльцовую вену. Кровь собирают в круглодонные центрифужные пробирки, плотно закрывают пробками и помещают в термостат при температуре 37-38° приблизительно на 1 час (до отделения сыворотки). По извлечении из термостата сгустки крови отделяют от стенок и дна стеклянной палочкой и для лучшей ретракции помещают пробирки на 2 часа в холодильник на сутки. Центрифугат (или отстой) отсасывают пипеткой или шприцем и хранят в хорошо закупоренных пробирках в холодильнике.

Получение цитотоксического нефрита

Кролику среднего веса вводят внутрибрюшинно 6-8 мл нефротоксической сыворотки. Нефрит развивается обычно на 2-4-е сутки после инъекции.