Занятие 23. Патология свертывающей системы крови

Цель занятия

Изучить возможные пути возникновения нарушений в системе свертывания крови (на примере экспериментальной механической желтухи у собак).

Подготовка к занятию

Студенты готовятся к данному занятию в объеме следующих вопросов.

1. Современное представление о механизме свертывания крови.

2. Классификация нарушений свертываемости крови.

3. Техника определения: а) времени рекальцификации плазмы; б) количества фибрина; в) протромбинового индекса; г) количества Ас-глобулина; д) толерантности плазмы к гепарину; е) тромбинового времени; ж) свободного гепарина крови.

^* (Из расчета на одно рабочее место.)

Подготовка подопытной собаки

Механическая желтуха у собаки достигается перевязкой общего желчного протока.

У животного, находящегося под любым видом обезболивания, срединным разрезом (12-15 см) вскрывают брюшную полость. Рану максимально расширяют ранорасширителем. Кишечник отодвигают в левую нижнюю часть брюшной полости. Находят фиксированную двенадцатиперстную кишку, которую слегка оттягивают книзу: этим достигается натяжение общего желчного протока. Под него подводят лигатуру при помощи иглы Дешампа, проток перевязывают. Рану послойно зашивают. Вводят антибиотики.

Приготовление плазмы, свободной от Ас-глобулина

Взятая в стерильных условиях плазма выстаивается в холодильнике (+4°) 7-10 дней. За это время весь Ас-глобулин успевает инактивироваться.

Рис. 24. Свертывающая система крови и ее нарушения (В. С. Гигаури и Р. Ф. Юрин, 1963)

Тонкие сплошные линии - факторы и процессы, дающие свертывающий эффект; пунктирные линии - факторы, дающие противосвертывающий эффект; плюс - повышение, минус - понижение концентрации или активности различных компонентов свертывающей системы крови; плюс или минус, взятый в скобки, означает, что данный вариант патогенеза имеет меньшее практическое значение.

Приготовление раствора тромбопластина

100 мг сухого тромбопластина взвешивают в 10 мл физиологического раствора, нагревают на водяной бане при температуре 50-55° 10 минут при постоянном помешивании. Затем пробирку ставят в холодильник (+4°) на 30 минут, после чего центрифугируют 2 минуты (при 1000 об/мин). Опалесцирующая жидкость отсасывается и используется как раствор тромбопластина. При хранении в холодильнике годен в течение недели.

Примечание. Сухой тромбопластин можно изготовить самим из свежего мозга человека (погибшего от случайной травмы) или собаки. Для этого мозг освобождают от сосудов и мозговых оболочек и тщательно отмывают от крови. Скальпелем соскабливают серое вещество и тщательно (!) растирают в ступке минут 40.

Образовавшуюся массу тонким слоем размазывают на стекле и высушивают при комнатной температуре недели 2-3. По истечении этого срока порошок тромбопластина соскабливают и проверяют на активность. Оксалатная плазма здорового человека при добавлении к ней хлористого кальция и раствора приготовленного тромбопластина должна свертываться за 25-30 секунд. В запаянных ампулах сухой тромбопластин сохраняет свою активность в течение 3 лет.

Приготовление раствора тромбина

Для работы необходим раствор тромбина, содержащий 1 единицу активности в 1 мл.

Определение единиц тромбина производится с цитратной плазмой человека: 10 мг тромбина растворяют в 10 мл физиологического раствора. 1 мл раствора тромбина добавляют к 1 мл плазмы и при температуре 37° устанавливают время свертывания. Нужно прибавить столько физиологического раствора к тромбину, чтобы плазма после добавления тромбина свертывалась за 30 секунд. Объем физиологического раствора в миллилитрах, в котором растворен 1 мг тромбина, покажет количество единиц активности тромбина в 1 мг сухого препарата. Для приготовления необходимого раствора тромбина берут соответствующую навеску сухого тромбина

Взятие крови

Кровь на исследование берут из вены в 2 пробирки. В 1-й пробирке кровь смешивают с 1,34% раствором оксалата натрия в пропорции 9:1, во 2-й - с 3,8% раствором цитрата натрия в той же пропорции. Центрифугируется 10 минут при 2000 об/мин. Плазму отсасывают и хранят в холодильнике. Годна для использования в течение 3 часов.

Наименование опытов и методика их проведения

Опыт 1. Oпpeделение времени рекальцификации плазмы и количества фибрина (воздушно-сухим методом). В пробирку, находящуюся на водяной бане (в стаканчике с водой 37-38°), берут 0,1 мл цитратной плазмы крови контрольной собаки, через 60 секунд прибавляют 0,1 мл 5% раствора хлористого кальция, перемешивают, одновременно пускают секундомер (или замечают время по секундной стрелке ручных часов). Отмечают время начала образования сгустка - время рекальцификации плазмы.

Через 3-4 минуты сгусток наматывается на стеклянную палочку, затем его извлекают из пробирки, тщательно высушивают путем сдавливания между двумя листками фильтровальной бумаги и взвешивают на торсионных весах. Получается количество воздушно-сухого фибрина.

Определения производятся и с плазмой подопытной собаки. Эти и все последующие определения дублируются.

Опыт 2. Определение протромбинового индекса. В пробирку, находящуюся на водяной бане, берут 0,1 мл нормальной оксалатной плазмы и прибавляют 0,1 мл раствора тромбопластина. Через 30 секунд прибавляют 0,1 мл 0,55% раствора хлористого кальция и одновременно пускают секундомер. Отмечается время свертывания смеси - время протромбинового комплекса. Затем определяется время протромбинового комплекса плазмы подопытной собаки.

Протромбиновый индекс получается, если время протромбинового комплекса здоровой плазмы разделить на время протромбинового комплекса исследуемой плазмы и полученное частное умножить на 1000.

Опыт 3. Определение количества Ас-глобулина. Исследуемую оксалатную плазму нормальной собаки разводят физиологическим раствором в 20 раз. Определение ведут на водяной бане.

В пробирку вносят 0,1 мл старой донорской плазмы и 0,1 мл разведенной нормальной плазмы. Через 30 секунд добавляют 0,05 мл раствора тромбопластина и еще через 30 секунд прибавляют столько же 0,55% раствора хлористого кальция. Одновременно пускают секундомер и регистрируют время свертывания смеси. Таким же образом определяют время свертывания смеси с опытной плазмой.

Количество Ас-глобулина равно времени свертывания смеси с нормальной плазмой, разделенному на время свертывания смеси с опытной плазмой и умноженному на 100.

Опыт 4. Определение толерантности плазмы к гепарину. В пробирку, находящуюся на водяной бане, вносят 0,5 мл оксалатной плазмы от здоровой собаки и 0,1 мл раствора гепарина; через 60 секунд туда же вводят 1 мл 0,28% раствора хлористого кальция и одновременно пускают секундомер. Определяют время свертывания плазмы. Определение проводится и с плазмой подопытной собаки.

Опыт 5. Определение тромбинового времени плазмы. В пробирку, находящуюся на водяной бане, вносят 0,1 мл нитратной плазмы здоровой собаки. Прибавляют 0,1 мл физиологического раствора и 0,1 мл раствора тромбина. Одновременно с введением тромбина пускают секундомер.

Время, прошедшее от момента введения тромбина до момента образования сгустка, и будет тромбиновым временем.

Определение делают и с плазмой подопытной собаки.

Опыт 6. Определение свободного гепарина плазмы. В пробирку, находящуюся на водяной бане, вносят 0,1 мл нитратной плазмы и 0,1 мл 0,1% раствора толуидиновой сини.

Через 30 секунд вводят 0,1 мл раствора тромбина и пускают секундомер. Укорочение времени свертывания смеси происходит за счет блокады гепарина толуидиновой синью.

Определения производят и с плазмой подопытной собаки.

Полученные данные у здоровой и подопытной собак: время рекальцификации, количество фибрина, протромбиновый индекс, количество Ас-глобулина, толерантность плазмы к гепарину, тромбиновое время и свободный гепарин крови - заносят в таблицу и сопоставляют. Используя прилагаемую схему свертывания, студенты делают заключение о причинах и механизмах нарушения свертываемости крови у собаки с экспериментальной механической желтухой.