Патология обмена веществ

Занятие 16. Патология углеводного обмена сахарный диабет, его патогенез

Цель занятия

Изучение изменений обмена веществ у животных с экспериментальным сахарным диабетом.

Подготовка к занятию

Студенты готовятся к данному занятию в объеме следующих вопросов.

1. Значение нейро-гуморальной регуляции углеводного обмена в организме и его нарушения.

2. Диабет клинический и экспериментальный. Патогенез сахарного диабета.

3. Методы получения экспериментального диабета.

4. Нарушения углеводного обмена при диабете. Факторы, обусловливающие развитие гипергликемии и глюкозурии.

5. Нарушение жирового, белкового и водного обмена, их происхождение и значение при диабете.

^* (Из расчета на одну группу студентов.)

Опыт 1. Для определения сахара в моче

Для определения ацетоновых тел в моче

Наименование опытов и методика их проведения

Опыт 1. Количественное определение сахара в крови, а также сахара и ацетоновых тел в моче у собаки с экспериментальным панкреатическим диабетом до и после введения инсулина. За 2-3 дня до начала занятия производится операция удаления поджелудочной железы. Под морфино-эфирным наркозом (морфин вводят за полчаса до операции из расчета 1 мл 1% раствора морфина на 4 кг веса) вскрывают брюшную полость (разрез по средней линии длиной 12-14 см). Из брюшной полости извлекают двенадцатиперстную кишку и с ней вместе поджелудочную железу. Отделение поджелудочной железы там, где это можно, производят при помощи ножниц; крупные сосуды предварительно перевязывают. От двенадцатиперстной кишки железу отделяют тупым путем при помощи анатомического пинцета и марлевой салфетки. Особенно тщательно отпрепаровывают сосуды двенадцатиперстной кишки, прикрытые тканью поджелудочной железы (перевязка и удаление этих сосудов вместе с железой приводят к некрозу двенадцатиперстной кишки). Протоки поджелудочной железы перевязывают.

После удаления поджелудочной железы брюшную стенку зашивают послойно.

При полном удалении железы через 6-8 часов после операции содержание сахара в крови возрастает примерно в 2 раза по сравнению с исходным.

У депанкреатизированной собаки из вены (бедренной или яремной) до введения инсулина и через 40-60 минут после его инъекции берут кровь. Инсулин вводят из расчета 3-4 ME на 1 кг веса животного.

Сахар определяют по методу Хагедорна - Иенсена (см. приложение).

У этой же собаки качественно определяют содержание сахара и ацетоновых тел в моче (демонстрация).

1. Определение сахара в моче. В пробирку наливают по 1-2 мл растворов (№ 1 и 2), нагревают до кипения и прибавляют 2-3 мл профильтрованной мочи. Пробирку вновь нагревают до кипения. При наличии сахара в моче происходит окрашивание жидкости в желтый цвет с выпадением красного осадка.

2. Определение ацетоновых тел в моче. В пробирку наливают 10 мл мочи, прибавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты, 3-5 капель нитропруссида натрия и наслаивают 2-3 мл нашатырного спирта. При наличии ацетоновых тел в моче на границе жидкостей образуется кольцо фиолетового цвета.

Опыт 2. Определение сахара и ацетоновых тел в моче крыс с аллоксановым диабетом. За 7 дней до занятия подопытной крысе вводят аллоксан из расчета 15 мг на 100 г веса (5% раствор аллоксана в физиологическом растворе).

В начале занятия 2 крысам (контрольной и подопытной) подкожно вводят по 10-30 мл подогретого до 36-37° физиологического раствора, после чего животных помещают в воронки, а мочу собирают в мерные цилиндры, гак как при диабете изменяется величина диуреза. Необходимо измерить количество мочи у подопытной и контрольной крыс и определить в ней наличие или отсутствие сахара и ацетоновых тел.

Опыт 3. Определение сахара в крови у кроликов с аллоксановым диабетом. Кролику за 3-4 недели до занятия в ушную вену вводят 5% раствор аллоксана в физиологическом растворе из расчета 160-170 мг на 1 кг веса.

На занятии берут кровь из ушной вены и определяют содержание сахара в крови по методу Хагедорна - Иенсена. Сравнивают с показателем уровня сахара нормальных кроликов.

Опыт 4. Гипогликемическая кома, основные проявления и экспериментальная терапия. Предварительно за сутки крысам вводят инсулин из расчета 2 единиц на 100 г веса.

За 2-3 часа до занятия повторно вводят инсулин в той же дозе.

На занятии студенты у этих крыс измеряют и регистрируют электрокардиограмму, подсчитывают число дыханий, измеряют температуру тела, берут кровь из хвостовой вены для определения содержания сахара, затем каждому подопытному животному вводят подкожно по 3 мл 40% раствора глюкозы. Повторно те же определения производят через 1 час после введения животным глюкозы.

Результаты обоих определений сравнивают, делают выводы.

Опыт 5. Почечный диабет у собаки. Собаке (самке) подкожно вводят 0,5-0,7 г флоридзина, разведенного в 4-5 мл 1 % раствора двууглекислой соды. Через 1 час у собаки берут из вены кровь и определяют количество сахара. Одновременно катетером берут мочу и определяют наличие сахара.

Приложение. Определение сахара в крови по методу Хагедорна - Иенсена

Принцип метода. Железосинеродистый калий K₃[Fe^...(CN)₆] восстанавливается альдегидной группой глюкозы в железосинеродистую соль - K₄[Fe^...(CN)₆], К₃[F^...(CN)₆] + глюкоза → K₄[F^...(CN)₆] + остаток K₃[F^...(CN)₆] + окисленная глюкоза (глюкуроновая кислота).

Определяя йодометрически остаток невосстановленной железосинеродистой соли, узнают количество израсходованного на окисление глюкозы железосинеродистого калия (т. е. количество имеющейся глюкозы).

Железосинеродистая соль восстанавливается йодистым калием (KJ): освобождается эквивалентное количество свободного йода:

Образовавшийся железосинеродистый калий осаждается в виде двойной цинк-калиевой соли (иначе - реакция обратимая):

Освободившийся йод оттитровывают гипосульфитом натрия

По имеющейся таблице вычисляют, какому количеству сахара в крови соответствует израсходованное количество гипосульфита.

^* (Из расчета на одно рабочее место для 2-3 студентов.)

Оснащение

1. В чисто вымытые и помеченные пробирки отмеривают по 5 мл 0,45% раствора сернокислого цинка и по 1 мл 0,1 н. раствора едкого натра. Образуется хлопьевидный осадок гидрата окиси цинка.

2. Микропипеткой набирают 0,1 мл исследуемой крови, тщательно вытирают кончик пипетки ватой и выдувают кровь в пробирку с приготовленным выше раствором. Пипетку несколько раз промывают данной жидкостью. Вымытой и высушенной микропипеткой берут 0,1 мл той же крови и опускают в другую пробирку (параллельное определение).

3. Ставят пробирки с кровью и 2 контрольные (для определения восстанавливающей способности реактивов) в кипящую водяную баню на 3 минуты; происходит свертывание белков крови.

4. По охлаждении фильтруют содержимое пробирок в соответственно помеченные эрленмейеровские колбочки. Каждую пробирку дважды тщательно промывают 3 мл дистиллированной воды, последнюю сливают на фильтр.

5. К фильтрату прибавляют по 2 мл отмеренного точной пипеткой содово-щелочного раствора железосинеродистого калия.

6. Штатив с эрленмейеровскими колбочками помещают в кипящую водяную баню на 15 минут.

7. По охлаждении в каждую колбочку приливают по 2 мл хлорцинк-йодистого реактива и уксусной кислоты.

8. Прибавляют по 2 капли крахмала: раствор становится сине-черным.

9. Титруют гипосульфитом до полного обесцвечивания. Отмечают количество гипосульфита, пошедшего на титрование раствора в каждой колбочке.

Для каждого исследования берут среднее из двух параллельных определений (если есть небольшое расхождение) и ищут по прилагаемой таблице, какому количеству глюкозы оно соответствует. Если титр гипосульфита не вполне точен, то в показания микробюретки вносят поправку согласно фактору раствора. Из исследуемой величины вычитают то количество глюкозы, которое соответствует слепому опыту. Полученная разность будет соответствовать количеству миллиграммов сахара, содержащихся в 100 мл крови.

Пример. На титрование одной пробирки с кровью пошло 1,34 мл гипосульфита, на титрование другой (параллельной) - 1,37 мл, средняя величина между ними 1,35 или 1,36 мл. Ищем в первом вертикальном столбце таблицы цифру 1,3, в верхней строчке - числа 0,05 и 0,06, на месте пересечения находим 115 и 113, берем среднее 114. Отсюда вычитаем величину слепого опыта: на титрование контрольных пробирок пошло 1,97 и 1,96 мл, что соответствует по таблице цифрам 0,07 и 0,05, берем среднее 0,06. Из 114 вычитаем 0,06. Цифра 108 означает количество миллиграммов сахара в 100 мл крови (108 мг %).

Таблица для определения сахара в крови по Хагедорну - Иенсену