Иммуногенная реактивность организма

Занятие 12. Цитотоксины, их происхождение и значение в организме

Цель занятия

Ознакомиться с методами обнаружения цитотоксинов (сперматоксинов) в сыворотке крови иммунизированного животного и с их биологическим действием.

Подготовка к занятию

Студенты готовятся к данному занятию в объеме следующих вопросов.

1. Иммуногенная перестройка - одна из форм защиты организма в ответ на воздействие антигенного раздражителя (микроба, токсина, чужеродных клеточных элементов, чужеродных белков).

2. Основные проявления иммунитета: выработка антител, усиление фагоцитарной реакции, повышение общей устойчивости к специфическому антигену.

3. Механизмы иммуногенной реактивности. Роль нервных и гуморальных факторов в развитии иммунитета.

4. Цитотоксины, их происхождение, свойства и механизмы действия. Роль отечественных ученых в учении о цитотоксинах.

^* (Из расчета на одну группу студентов.)

Опыт 1

¹ (Из расчета на 2-3 студентов.)

Наименование опытов и методика их проведения

Опыт 1. Определение наличия титра сперматоксинов в сыворотке иммунного животного с помощью реакции связывания комплемента.

У собак вырезают семенник, освобождают его от оболочек и растирают в стерильной ступке со стеклянным песком в соотношении 1:1. Затем эту смесь разводят стерильным физиологическим раствором (1 часть антигена на 4 части физиологического раствора); получается эмульсия в виде сливок.

Эмульсии дают отстояться или ее центрифугируют в течение 5-8 минут. Центрифугат сливают в стеклянную колбу и используют в качестве антигена для иммунизации животных.

Антиген вводят кроликам внутрибрюшинно (стерильно!) 5-6 раз в возрастающих дозах с 5-6-дневными промежутками.

Иммунизация          Количество антигена (в мл) 
    1-я                      2 
    2-я                      3 
    3-я                      4 
    4-я                      5 
    5-я                      5

После 4-й иммунизации наличие антител в крови и их титр проверяют реакцией на связывание комплемента.

Для приготовления разведений испытуемой сыворотки берут 0,5 мл ее исходного разведения (1:10) в первую пробирку и доливают 4,5 мл физиологического раствора, встряхивают: получается разведение 1:100.

Из этой пробирки переносят по 1 мл разведенной сыворотки в остальные пробирки и добавляют другой пипеткой физиологический раствор в следующих количествах: во 2-ю пробирку - 0,5 мл (разведение 1:150), в 3-ю - 1 мл (разведение 1:200), в 4-ю - 1,5 мл (разведение 1:250) и в 5-ю - 2 мл (разведение 1:300). На каждой пробирке обозначают разведение. Берут второй штатив на 10 гнезд с 6 пробирками и переносят в них по 0,5 мл каждого разведения сыворотки, начиная с самого слабого. В оставшуюся пустой первую пробирку наливают 0,5 мл исходного разведения (1:10) сыворотки.

Во все пробирки доливают 0,5 мл антигена и 0,5 мл комплемента. Для контроля берут 4 пробирки: в 1-й - заменяют физиологическим раствором антиген, во 2-й - антитело, в 3-й - комплемент; в 4-й - антитело заменяют 0,5 мл нормальной сыворотки. Все пробирки надписывают, энергично встряхивают и ставят в термостат на 45 минут для фиксации комплемента коллоидным комплексом антиген - антитело.

Затем во все пробирки доливают по 1 мл хорошо смешанной гемолитической системы, встряхивают и снова помещают в термостат на 45 минут. Отсутствие гемолиза (бесцветный верхний слой жидкости) является доказательством происшедшего связывания комплемента, т. е. свидетельствует о наличии в крови специфического антитела. Титр сперматоксинов устанавливают по наибольшему разведению сыворотки, давшему задержку гемолиза.

Опыт 2. Биологическое действие сперматоксической сыворотки (микроскопическое исследование). На стекле с лункой делают тонкий ободок из вазелина вокруг лунки. На покровное стекло в центре помещают маленькую каплю эякулята собаки.

Покровное стекло накрывают стеклом с лункой гак, чтобы капля проецировалась на середину лунки, но не прикасалась к стеклу. Затем препарат быстро переворачивают покровным стеклом вверх, без промедления ставят под микроскоп и рассматривают под малым увеличением. Наблюдают энергичное движение сперматозоидов, зарисовывают их внешний вид.

Таким же способом готовят 2-й препарат с той лишь разницей, что на покровное стекло наносят каплю эмульсии сперматозоидов и каплю испытуемой сперматоксической сыворотки. Под микроскопом наблюдают быстрое прекращение движения сперматозоидов и развивающуюся их деформацию (набухание и распад).

В 3-м (контрольном) препарате к эмульсии сперматозоидов прибавляют каплю сыворотки крови нормального животного. Под микроскопом в первые 5-10 минут заметной разницы, сравнительно с первым препаратом, не наблюдается.